测序级重组胰蛋白酶自切情况分析-

来源：作者：华仔浏览：401 时间：2017-10-21 16:00

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摘要：测序级修饰突变重组胰蛋白酶自切情况分析一、通过LC-MS方法比较以下四种测序级胰蛋白酶样品的自切情况：（1）tpck处理的测序级胰蛋白酶（mST,Promega）；（2）测序级重组胰蛋白酶（SRT,雅心生物）；（3）测序级修饰重组胰蛋白酶（mSRT，雅心生物）;（4）测序级修饰突变重组胰蛋白酶（mmSRT，雅心生物）。方法：使用pH8.0 50mM NH4HCO3缓冲液将胰蛋白酶溶解或者稀释，终浓

测序级修饰突变重组胰蛋白酶自切情况分析

一、通过LC-MS方法比较以下四种测序级胰蛋白酶样品的自切情况：
（1）tpck处理的测序级胰蛋白酶（mST,Promega）；
（2）测序级重组胰蛋白酶（SRT,雅心生物）；
（3）测序级修饰重组胰蛋白酶（mSRT，雅心生物）;
（4）测序级修饰突变重组胰蛋白酶（mmSRT，雅心生物）。

方法：
使用pH8.0 50mM NH₄HCO₃缓冲液将胰蛋白酶溶解或者稀释，终浓度为0.05mg/ml,然后在37℃保持5h，然后使用LC-MS进行分析。

信号强度 Promega(修饰过)(mST) 雅心(未修饰)(SRT) 雅心(修饰)(mSRT) 雅心(修饰和突变)(mmSRT) 肽段1 30970 66064 19025 - 肽段2 5587 41032 - - 肽段3 9011 234266 - - 肽段4 23456 180728 - -

结论:
1）使用甲基化修饰的胰蛋白酶只能阻断赖氨酸自切位点，但是不能阻断精氨酸自切位点。
2）修饰的程度影响胰蛋白酶的自切程度（mST和mSRT比较）。
3）突变和修饰结合的胰蛋白酶可以完全抑制胰蛋白酶自切（mmSRT）。

二、通过RP-HPLC方法分析对比Promega mST，雅心生物mSRT和雅心生物mmSRT的自切位点情况。

方法：
使用pH8.0 50mM NH₄HCO₃缓冲液将胰蛋白酶溶解或者稀释，终浓度为0.05mg/ml，使用RP-HPLC检测，3小时后分析结果。

结论：
RP-HPLC的结果与LC-MS结果一致。
对于Promega修饰胰蛋白酶(mST)，和雅心生物mSRT，原始的胰蛋白峰消失，形成一个新的自切的胰蛋白酶峰。
而对于修饰和突变的测序级胰蛋白酶（雅心生物mmSRT），完整的原始的胰蛋白酶峰被保存，即不存在自切位点。如图所示。

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